布鲁克双光子显微镜光子探测

目前，脑科学的研究在全球范围内如火如荼，中国的脑计划也即将启动。其中，全景式分析脑连接图和功能动态图的研究成为重点研究方向，如何打破尺度壁垒，将微观神经元和突触的信息处理和个体行为信息与全脑融合，是该领域亟待解决的关键挑战。2021年1月6日，由北京大学分子医学研究所牵头，北京大学信息科学与技术学院电子系、工程学院和中国人民医学科学院组成的跨学科团队在NatureMethods上在线发表了一篇题为《大视场、多平面、长程脑成像的微型双光子拷贝》的文章。本文报道了第二代小型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0。其成像视场是团队2017年发布的第1代小型化显微镜的7.8倍。同时具有三维成像能力，获得了小鼠自由运动行为时大脑三维区域数千个神经元清晰稳定的动态功能图像，实现了对同一批次神经元一个月的跟踪记录。双光子显微镜使用的是高能量锁模脉冲器。布鲁克双光子显微镜光子探测

高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例生物领域：贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。信息领域：美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点，避免了层与层之间的互相干扰，极大地提高了数据储存密度。荧光激光双光子显微镜光子跃迁如果已经有了飞秒光，就可以几套双光子显微镜共享一台，只需分光即可。

首先，双光子成像采用波长范围约在700~1000 nm的近红外光激发，在组织中的散射系数较小，穿透性很好，因此非常适合厚样本的观察。同时，由于是近红外光激发，也能避免样品中激发波长较短的自发荧光物质的干扰，可获得较强的荧光信号（如下图）。所以双光子成像具有较深的穿透力和较小的光毒性。通常在活物脑组织中双光子显微镜有效成像深度可达200~500 μm，能够较好地进行三维成像。双光子成像的另一大优势在于精确的空间点聚焦性。一般条件下，物质只会被单光子激发，只有在光子密度足够高的情况下，物质才会吸收两个光子从而被激发，所以，双光子只会在光子密度蕞高的物镜焦点附近发生，很少产生焦平面外的杂散光（如下图）。这种性质既提高了成像质量，也降低了样本的光漂白、光损伤区域。基于这些优势，使得双光子显微镜非常适合对活细胞、活组织进行长时间在体成像。

在传统宽场显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整个样品的重叠像，没有纵向分辨能力。单光子激光共聚焦显微镜用***有效滤除了杂散光，分辨率有了本质上的提高，拥有了对样品的特定焦平面精细成像的能力，可以进行三维成像、动态成像等。然而，***在滤除杂散光的同时也将大部分来自焦平面的荧光滤除了，只有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度，需要加大激发光功率，这又会导致对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白增加。双光子显微镜比较大的优势来源于其双光子光源的非线性光学效应，与单光子共聚焦显微镜比较大的不同在于无须使用***限制光学散射，其具体优势如下。双光子显微镜可以用于局部微蚀镭射磨皮后的胶原重塑的检测。

新一代微型化双光子荧光显微成像系统的成功研制是国家重大科研仪器研制专项的一个硕果。它彰显了北京大学在生物医学成像领域先期布局的前瞻性，锻炼了一支以年轻PI和硕博研究生为主体、具有学科交叉背景和重要技术创新能力的“中国智造”队伍。目前，该研发团队正在领衔建设“多模态跨尺度生物医学成像”十三五国家重大科技基础设施，积极参与即将启动的中国脑科学计划。可以期待，微型化双光子荧光显微成像系统将为实现“分析脑、理解脑、模仿脑”的战略目标发挥不可或缺的重要作用上海双光子显微镜就找因斯蔻浦。进口2PPLUS双光子显微镜授权商

双光子显微镜在多个领域研究中已有许多成功实例。布鲁克双光子显微镜光子探测

后续实验使用碘化丙啶(PI)来指示细胞在7、8、9和10分钟的延时观察后的损伤情况，来验证该光学系统对活细胞长期观察的适用性。在观察期间，88个焦点以100毫秒的曝光时间，曝光间隔1s照射样品，激发强度为3.21×104W/cm2，激发波长为525nm，使用前文提到的60×物镜及1.0AU孔径，图5(a)-(d)为引入PI的成像图，(e)-(h)为相应的相应衬度图。改变激发条件为每照射500ms间隔5s，得到相应的(i)-(p)。由图像可知，延时观察小于8分钟的情况下不造成可见细胞损伤，对于实际3D延时成像，由于焦平面是移动的，所以预期细胞存活时间会更长，可见这是一种在3D在体延时成像中具有很大优势的成像方案。布鲁克双光子显微镜光子探测