investigator双光子显微镜应用

双光子荧光显微镜是激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术相结合的新技术。双光子激发的基本原理是:在光子密度较高的情况下，荧光分子可以同时吸收两个波长较长的光子，经过短暂的所谓激发态寿命后，发射一个波长较短的光子；效果和用波长为长波长一半的光子激发荧光分子是一样的。双(多)光子成像的优点是具有更深的组织穿透深度，红外光可以在平面上探测到极限为1mm的组织区域；因为信号背景比高，所以具有更高的对比度；由于激发体积小，具有定点激发、光毒性小的特点；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，更加安全。双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。investigator双光子显微镜应用

在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，然后发射出一个波长较短的光子，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在单光子激发时，在波长为350nm光的激发下发出450nm荧光；而在双光子激发时，可采用700nm的激发光得到450nm荧光。由于双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，从而可以减少光漂白和光毒性带来的不利影响。美国2PPLUS双光子显微镜的成像视野双光子显微镜使用高能量锁模脉冲器。

细胞内钙离子作为重要的信号分子其作用具有时间性和空间性。当个细胞兴奋时，产生了一个电冲动，此时，细胞外的钙离子流入该细胞内，促使该细胞分泌神经递质，神经递质与相邻的下一级神经细胞膜上的蛋白分子结合，促使这一级神经细胞产生新的电冲动。以此类推，神经信号便一级一级地传递下去，从而构成复杂的信号体系，终形成学习、记忆等大脑的高级功能。在哺乳动物神经系统中，钙离子同样扮演着重要的信号分子的角色。静息状态下大部分神经元细胞内钙离子浓度约为50-100nM，而细胞兴奋时钙离子浓度能瞬间上升10-100倍，增加的钙离子对于突触囊泡胞吐释放神经递质的过程必不可少。众所周知，只有游离钙才具有生物学活性，而细胞质内钙离子浓度由钙离子的内外流平衡所决定，同时也受钙结合蛋白的影响。细胞外钙离子内流的方式有很多种，其中包括电压门控钙离子通道、离子型谷氨酰胺受体、烟碱型胆碱能受体（nAChR）和瞬时受体电位C型通道（TRPC）等。神经元钙成像的原理就是利用特殊的荧光染料或钙离子指示剂将神经元中钙离子浓度的变化通过荧光强度表现出来，以反映神经元活性。该方法可以同时观察多个功能或位置相关的脑细胞。

在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民医学科学院组成跨学科团队，历经三年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，并获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申请多项。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。

双光子的来源:飞秒激光的双光子吸收理论早在1931年就由诺贝尔奖获得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因为激光而得到实验验证，但WinfriedDenk用了近30年才发明了双光子显微镜。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要理解非线性过程。双光子吸收相当于和频产生的非线性过程，需要极高的电场强度，电场取决于聚焦光斑的大小和激光脉冲宽度。聚焦光斑越小，脉冲宽度越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只与物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只有激光脉冲宽度。基于以上分析，能够输出高重复率(100MHz)的超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光已经成为双光子显微镜的标准激发光源。这再次显示了双光子显微镜的优势:双光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光强较低，无法激发，所以双光子成像更清晰。成像平台倒置双光子显微镜启用显微镜自带调焦设备。进口荧光双光子显微镜磷光寿命计数

双光子显微镜大量运营在实验室当中；investigator双光子显微镜应用

配合了双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。investigator双光子显微镜应用