布鲁克多光子显微镜成像深度

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一种加快2PM轴向扫描速度的方法[2]。在光学显微镜中，物镜或样品的缓慢轴向扫描速度限制了体积成像的速度。近年来，通过使用远程聚焦技术或电可调谐透镜（ETL）已经实现了快速轴向扫描；但是，远程聚焦中反射镜的机械驱动会限制轴向扫描速度，ETL会引入球面像差和更高阶像差，从而无法进行高分辨率成像。为了克服这些局限性，该组引入了一种新颖的光学设计，能将横向扫描转换为可用于高分辨率成像的无球差的轴向扫描。该设计有两种实现方式，第一种能够执行离散的轴向扫描，另一种能够进行连续的轴向扫描。具体装置如图3a所示，由两个垂直臂组成，每个臂中都有一个4F望远镜和一个物镜。远程聚焦臂包含一个检流扫描镜（GSM）和一个空气物镜（OBJ1），另一个臂（称为照明臂）由一个水浸物镜（OBJ2）构成。将这两个臂对齐，以使GSM与两个物镜的后焦平面共轭。准直的激光束被偏振分束器反射到远程聚焦臂中，GSM对其进行扫描，进而使得OBJ1产生的激光焦点进行横向扫描。多光子显微镜已经被生物学家普遍的运用于实验中。布鲁克多光子显微镜成像深度

细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激继续存在，Ca2+荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况，研究发现，配了在粘着过程中，Ca2+荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等等，Ca2+荧光信号强度也会发生很强的变化。离体多光子显微镜多光子激发多光子显微镜涉及医学、生物学、化学、物理学、电子学、工程学等学科，生产工艺相对复杂，进入门槛较高。

在多光子显微镜（也称为非线性或双光子显微镜）中，以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的，因为它们可以更深地穿透样品进行3D成像，并且因为它们不会损坏样品，从而延长样品寿命。为了实现多光子激发，照明光束在空间上聚焦（使用光学器件），同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个（或更多）光子同时到达同一位置（即荧光团分子）的概率。多光子显微技术的例子包括二次谐波产生(SHG)、三次谐波产生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)和受激发射耗尽(STED)显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器，因此选择能够比较大限度地减少脉冲色散的光学组件很重要，并且激光反射二向色镜应具有低GDD特性。

与传统的单光子宽视野荧光显微镜相比，多光子显微镜具有光学切片和深层成像等功能，这两个优势极大地促进了研究者们对于完整大脑深处神经的了解与认识。2019年，JeromeLecoq等人从大脑深处的神经元成像、大量神经元成像、高速神经元成像这三个方面论述了相关的MPM技术。想要将神经元活动与复杂行为联系起来，通常需要对大脑皮质深层的神经元进行成像，这就要求MPM具有深层成像的能力。激发和发射光会被生物组织高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，虽然可以通过增加激光强度来解决散射问题，但这会带来其他问题，例如烧坏样品、离焦和近表面荧光激发。增加MPM成像深度比较好的方法是用更长的波长作为激发光。多光子显微镜是衡量一个国家制造业和高科技发展水平的重要标准之一。

使用MPM对神经元进行成像时，通过随机访问扫描—即激光束在整个视场上的任意选定点上进行快速扫描—可以只扫描感兴趣的神经元，这样不仅避免扫描到任何未标记的神经纤维，还可以优化激光束的扫描时间。随机访问扫描可以通过声光偏转器（AOD）来实现，其原理是将具有一个射频信号的压电传感器粘在合适的晶体上，所产生的声波引起周期性的折射率光栅，激光束通过光栅时发生衍射。通过射频电信号调控声波的强度和频率从而可以改变衍射光的强度和方向，这样使用1个AOD就可以实现一维横向的任意点扫描，利用1对AOD，结合其他轴向扫描技术可实现3D的随机访问扫描。但是该技术对样本的运动很敏感，易出现运动伪影。目前，快速光栅扫描即在FOV中进行逐行扫描，由于利用算法可以轻松解决运动伪影而被普遍的使用。多光子显微镜作为一种研究微观结构和功能的技术，在众多领域得到了普遍的应用。离体多光子显微镜多光子激发

多光子显微镜在临床前评价IA形态、细胞外基质、细胞密度和血管形成等方面显示出强大的作用。布鲁克多光子显微镜成像深度

对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。布鲁克多光子显微镜成像深度