S100A4免疫组化

免疫荧光的制作：样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）：对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。免疫荧光技术具有高灵敏度和高特异性，可以检测非常低浓度的目标分子。S100A4免疫组化

细胞的固定及免疫荧光：注意事项：（1）取细胞爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。（2）种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。（3）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。（4）细胞爬片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。或者放于暗盒内，暂时保存于4度冰箱，尽快拍照。（5）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。S100A4免疫组化免疫荧光技术通过荧光信号的观察来确定抗原或抗体的分布和定位。

细胞的固定及免疫荧光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。

荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。在实际工作中，荧光抗原技术应用较少，因此通常将其称为荧光抗体技术或免疫荧光技术。

细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化。在进行细胞免疫荧光过程中，需要用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长，进而进行细胞的免疫荧光。实验前准备：1.胰酶;2.DMEM细胞培养基;3.细胞培养12孔板或者6孔板;4.爬片。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度。免疫荧光技术是一种以荧光素标记抗体来定位抗原物质的高度发达的标记免疫技术。免疫荧光技术可以用于研究病毒传播和免疫应答。Glucagon免疫

免疫荧光在医学诊断中起着重要作用，可以用于检测病原体、肉瘤标志物等。S100A4免疫组化

直接免疫荧光：单抗体（一抗）用于免疫染色和检测目标蛋白。荧光素结合的一抗直接与目标抗原结合，并使用成像显微镜观察。直接免疫荧光的优点：由于无需为两种抗体选择不同的物种反应性，从而降低了物种交叉反应性问题。与间接免疫荧光相比，时间缩短（操作步骤减少）。直接免疫荧光的缺点：不允许通过二抗进行信号放大；检测灵敏度降低；荧光素结合一抗的选择有限；与使用荧光二抗的检测相比，更昂贵。间接免疫荧光：使用两种抗体（一抗和二抗）进行免疫染色并检测目标蛋白。首先，用特异性一抗标记目标蛋白。然后，荧光素结合的二抗（与一抗具有不同的物种反应性）识别结合的抗原-抗体复合物并与一抗结合。由于一个以上的二抗可以与一抗结合，荧光信号被放大，提供了更高的检测灵敏度。S100A4免疫组化

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