奉贤区组蛋白抗体抗体参数

问题                     可能的原因                         处理方法

印迹上出现条纹     在凝胶的蛋白负荷过量。       准确测量蛋白浓度，载入较少的蛋白。

印迹有污染或模糊   凝胶平衡不当，或在实验过程中收缩 检查凝胶平衡时间。

采用丽春红S染色时，     转膜无效                转膜时，小心除去气泡。                                              

印迹染色较差                                   确保在电转过程中因为温度过高而产生气泡或凝胶/膜变形      

采用丽春红S染色时，  在转膜过程中蛋白没有转移      检查设备（转膜盒、盒盖、电源）。

印迹没有染色          检查在转膜过程中凝胶和膜的顺序是   确保膜位于凝胶的右侧。

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免疫沉淀(又叫免疫沉淀(IP))

免疫沉淀是很有价值的研究工具，目的是研究某一特定蛋白的关键信息，包括：小规模蛋白纯化用于功能研究，N-端序列分析，蛋白-蛋白相互作用的研究，细胞或组织中蛋白相对丰度和分布的测定。免疫沉淀分析法的成功取决于两个主要因素：原始样品中抗原的丰度和抗体对该抗原的亲和力(一般需要108 M-1或以上的亲和力)。在开始免疫沉淀之前，确保特定的步骤有适当的实验对照。对照抗体在性质上尽可能与该特异性抗体类似。 静安区Upstate抗体抗体规格WB抗体的报价具体是多少呢?

对于探索性研究，Western blotting仍是优先平台，是用于评估新抗体和其它蛋白检测分析

法（如ELISA、基于微珠的分析法、流式细胞术和免疫组织化学）的标准。新技术的开发**减少Western blotting过程需要的时间（例如默克密理博的 SNAP i.d.® 2.0系统，目录编

号SNAP2MM），提高了WB实验的效率。

Western blotting的基本程序涉及下述关键步骤

样本制备

凝胶电泳

转膜

封闭非特异性结合

加入抗体

检测

Western Blot 实验流程图

Troubleshooting

问题                     可能的原因                         处理方法

这是为了避免或尽量减少冻融循环。抗体溶液不可反复冻融，因为这可以导致抗体。

聚集，从而引起活性丧失。因此，贮存溶液应在保存前先进行分装。未稀释抗体应在保存于-20℃之前分装，以尽量减少可使抗体变性的反复冻融循环。集中保存抗体可预防或尽量减少降解。可在抗体溶液中加入终浓度为50%的冷冻保护剂，如甘油，以预防冻融造成的损失。请勿将含甘油的抗体保存于-80℃。通常不对酶结合抗体进行冷冻，以免损失酶活性及其结合能力。 上海Sigma抗体的供应商。

通过改变参数（见第5.3节）和评估他们对梁色质回收率的影响来优化这些步骤。使用机械力，如杜恩斯匀浆器或坡璃珠改善细脆溶辉。优化裂解步要和避免起泡。
在甲醛中培养时间过长可能掩盖经ChIP抗体识别所需要的表位。如果您使用的是单克隆抗体，此问题可能更加严重。过度交联也可能导致超声处理时复合物难以形成。优化交联步骤∶甲醛的**终液度应为1%;您应确定***的交联时间，然后再继绩进行实验。在研究方案的后续步骤中，交联不足可能引起靶蛋白从DNA解离。

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对您的特定应用，增加（和优化）试剂浓度和培养时间。

检查确保检测试剂按建议的方法正确贮藏和使用。

从抗体缓冲液中除去吐温。

配制少量工作液（1mL），在暗室中加入HRP偶联二抗1mL。

应观察到可见的蓝光。

在再杂交过程中可能有抗原损失。

信号较弱   在凝胶上的蛋白不足   在凝胶上载入更多的蛋白，或在载入之前浓缩样品，或使用免疫沉淀以增加在凝胶运行的中靶蛋白量。

                               使膜曝光时间延长（1-2小时）。

转移到膜上的蛋白过少--优化转膜条件，如转膜缓冲液pH、膜类型和电压等。 奉贤区组蛋白抗体抗体参数

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